Основные аспекты конструирования праймеров для диагностики фомоза лесных древесных видов методом видоспецифической полимеразной цепной реакции

Abstract

В статье рассмотрены основные аспекты разработки ПЦР тест-системы для диагностики фомоза лесных древесных видов и видоспецифической идентификации возбудителей инфекции. На основании использования методов секвенирования нового поколения на базе Ion PGM Torrent проведено определение нуклеотидной последовательности генома одного из доминирующих патогенов в лесных питомниках Беларуси – возбудителя фомоза сеянцев хвойных пород Phoma sp.1 (размер генома ? 40 млн. пар нуклеотидов). По результатам секвенирования аннотирована последовательность рибосомальной ДНК Phoma sp.1 – 7540 пар оснований. Данный регион был выбран в качестве генетического маркера при разработке ПЦР тест-системы для диагностики фомоза лесных древесных растений, так как характеризуется видоспецифичностью и консерватизмом внутри вида. С использованием специального программного обеспечения Primer3web version 4.0.0 и Primer Blast проведена оптимизация термодинамических параметров видоспецифической полимеразной цепной реакции (SS-PCR) и сконструированы праймеры для идентификации возбудителей фомоза (50 пар). Функциональность праймеров проверена в базе данных международного генного банка GenBank Национального центра биотехнологической информации (США) c использованием программ nucleotide Blast и Primer Blast. Установлено, что разработанный набор характеризуется различной степенью специфичности к фомоподобным грибам: от отдельных видов до рода. Размер амплифицируемых продуктов (70–190 п.н.) оптимально подходит для проведения количественной оценки возбудителей фомоза в клетках растений с использованием метода ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR).